帖子主题: 聚合酶链式反应扩增DNA  

论坛级别: ★学员
学术等级: 兼职
发帖:15
经验:9
鲜花:0
勋章:0
离线
发表于:Thu Jan 19 09:49:24 CST 2017

聚合酶链式反应扩增DNA

实验目的
熟悉通过聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,简称PCR)体外扩增特定DNA-片段的技术原理和实验方法。
实验原理

PCR是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)存在的条件下,依赖于DNA聚合酶的酶促DNA合成反应。反应分为三步:(1)变性(denaturation): 双链DNA在高温条件下解开成单链;(2)退火(annealing):当温度降低时,引物与单链模板DNA 的特定序列结合;(3)延伸(extension): DNA聚合酶以单链DNA为模板,按照碱基互补配对原则,从引物的3’端按照5’→3’方向合成新链。以上述三步为一个循环,每个循环合成的DNA都可作为下一个循环的模板,经过多个循环后,特定的DNA-片段数量可以增加到2n倍。(基金论文,你提供实验材料,我免费给你做实验,成果归你享有Q往圣科技3452125268) 本实验根据噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)基因组中的crtE序列(crtE编码牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶,参与类胡萝卜素的合成),设计一对引物,从基因组中扩增该基因。

器材与试剂】(Q往圣科技3452125268提供12万种免费质粒)
1.实验仪器 PCR仪,微量移液器,电泳仪,DNA电泳槽,紫外分析仪
2.实验试剂
Taq DNA聚合酶,PCR缓冲溶液(10×),10 mmol/L dNTP 混合液,λDNA/EcoR I,Hind III,琼脂糖,DNA载样缓冲溶液(10×),溴化乙锭染色液,TAE缓冲溶液(50×)(Q往圣科技3452125268提供张峰Nature biotechnology的CRISPR/cas9免费送)
1.
实验材料
噬夏孢欧文氏菌基因组DNAPCR专用薄壁管
引物15’-GAATTCCATATGACGGTCTGCGCAAAAAAAC-3’
引物25’-ATTCTCGAGTTAACTGACGGCAG-3’


实验步骤】(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装)
1在0.2 mL的PCR薄壁管中加入下列组分配成20 μL反应体系:2 μL PCR缓冲溶液(10×),1 μL引物10.5 μmol/L),1 μL引物20.5 μmol/L),1 μL dNTP 混合液,1 μL Taq DNA 聚合酶,1 μL噬夏孢欧文氏菌基因组DNA(约10 ng),13 μL 无菌双蒸水。
2PCR参数设为:94℃预变性5 min94℃变性45 s52℃退火45 s72℃延伸1 min,共进行35个循环,最后72℃保温10 min
3.用1×TAE配制1%琼脂糖凝胶。(Q往圣科技3452125268提供12万种Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装)
2.
PCR反应体系中加入2 μL载样缓冲溶液,混合后,上样电泳。
3.
将凝胶用溴化乙锭染色30 min,于紫外分析仪内观察结果。
注意事项】(Q往圣科技3452125268提供12万种免费质粒加慢病毒包装)
1.本实验PCR反应体系应充分混合均匀。
2.应根据选购Taq DNA 聚合酶提供的使用说明,选择合适的PCR缓冲溶液,有的缓冲液中添加了Mg2+,有的则没有。
 
论坛级别: ★学员
学术等级: 兼职
发帖:15
经验:9
鲜花:0
勋章:0
离线
发表于:2017-01-19 09:54:39
Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装
快速回复主题

聚合酶链式反应扩增DNA


  您尚未登录,发表回复前请先登录,或者注册
  Ctrl+Enter直接发表