亲和层析纯化重组蛋白

实验目的

学习利用镍离子螯合树脂亲和纯化带有多聚组氨酸标签(His-tag)的重组蛋白。
实验原理

利用镍离子螯合树脂特异结合多聚组氨酸的特性,(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费送)若外源基因编码的目的蛋白在其N-末端或C-末端融合了His-tag,则具有His-tag的重组蛋白可特异结合在镍离子树脂上而将其纯化,经过低浓度咪唑溶液洗涤后,可用高浓度的咪唑溶液将重组蛋白从树脂上洗脱下来,纯化蛋白的纯度可用SDS-PAGE法进行检测。

器材与试剂
1.实验仪器
摇床,高速冷冻离心机,超声波细胞破碎仪,微量移液器,电泳仪,蛋白电泳槽

2.实验试剂
蛋白胨,酵母提取物,NaCl,1 mol/L NaOH,氨苄青霉素钠,1 mol/L IPTG(微孔滤膜过滤除菌), 0.1 mol/L NiCl2,
镍离子螯合树脂(His.BindResin,美国Novagen公司),结合缓冲溶液:0.5 mol/LNaCl,5 mmol/L咪唑,20 mmol/L Tris-Cl,pH8.0;洗涤缓冲液:0.5 mol/L NaCl,60 mmol/L咪唑,20 mmol/LTris-Cl,pH8.0;洗脱缓冲液:0.5 mol/L NaCl,0.5mol/L咪唑,20 mmol/LTris-Cl,pH8.0;30%凝胶贮液:29% 丙烯酰胺,1% N,N-亚甲双丙烯酰胺;10% 十二烷基硫酸钠(SDS),N,N,N’,N’-四甲基乙烯二胺(TEMED),10%过硫酸铵,标准分子量蛋白,(Q往圣科技3452125268提供张峰Nature biotechnology的CRISPR/cas9免费)蛋白电泳缓冲溶液:25 mmol/L Tris, 250 mmol/L 甘氨酸,0.1%SDS,pH8.3;1.5 mol/L Tris-Cl(pH8.0),1 mol/L Tris-Cl(pH6.8),蛋白栽样缓冲液(2×):50 mmol/L Tris-Cl(pH6.8),100 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT),2% SDS,10%甘油,0.1%溴酚蓝;染色液:0.2%考马斯亮蓝 R250,40%(v/v)甲醇,10%(v/v)乙酸;脱色液:40%(v/v)甲醇,10%(v/v)乙酸
3.实验材料
转化了pET-15bcrtE的
E.coliBL21(DE3)(工程菌)
实验步骤】(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)
1.取2 mL左右的树脂装入一小层析柱内,待凝胶沉淀且保护剂流净后,用10 mL蒸馏水冲洗凝胶,然后加入10 mL 0.1 mol/L NiCl2溶液,待其流干净后,用10 mL结合缓冲溶液平衡层析柱。
2.接种工程菌于20 mL100 µg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中,37,振荡培养(250 r/min)过夜。
3.将过夜培养物转接到500 mL含100 µg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中,37,振荡培养(250 r/min3 h,加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,继续培养4h
4. 培养物在4℃,5 000×g离心10 min,收集菌体。
5. 菌体重新悬浮于冰冷的20 mL结合缓冲溶液中,冰浴条件下用超声波破碎细胞15次(800W,工作时间10 s,间隔时间60 s)。
6.细胞裂解液于4℃,12 000×g离心30 min,取上清液,保留50 µL以备电泳分析
7.将其余上清液加到层析柱内,让其自然流过层析介质。
8.先用10 mL结合缓冲液冲洗层析柱,再用8 mL洗涤缓冲液洗涤层析柱。
9.用4 mL洗脱缓冲液洗脱目的蛋白,收集洗脱液。
10.分别取10 µL细胞裂解液、洗脱液与10µL蛋白载样缓冲液(2×)混合,煮沸5 min,SDS-PAGE分析,观察纯化效果。
注意事项】(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装。)层析过程中所使用的溶液不应含有EDTA、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇等能敖合金属离子的试剂,以免将树脂上的Ni2+洗掉,导致无法纯化出蛋白