帖子主题: 重组蛋白的Dot-Western blot 分析  

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发表于:Thu Jan 19 09:52:55 CST 2017
实验目的
熟悉利用Dot-Western blot进行微量重组蛋白鉴定分析的原理和方法。
实验原理
微量重组蛋白(纯化或未纯化的)固定在硝酸纤维素(NC)膜上以后,用脱脂奶粉封闭NC膜上其他结合位点,利用兔抗重组蛋白的抗体(一抗)可特异与重组蛋白结合的特点,当NC膜与一抗溶液温育时,(Q往圣科技3452125268提供12万种免费质粒加慢病毒包装)抗体可特异结合在重组蛋白上,当NC膜再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG的抗体(二抗兔)溶液温育时,则该抗体可特异的与一抗结合,将NC膜浸泡在含辣根过氧化物酶底物的溶液中,HRP与二氨基联苯胺(DAB)及H2O2反应生成褐色产物,沉淀于NC膜上重组蛋白所在部位,故可以检测目的蛋白的存在。
器材与试剂】(Q往圣科技3452125268提供免费基因慢病毒包装)
1.实验仪器
微量移液器,脱色摇床

2.实验试剂
封闭液:5%脱脂奶粉,150 mmol/L NaCl 20 mmol/L Tris-ClpH7.5;漂洗液:150 mmol/LNaCl 20 mmol/L Tris-ClpH7.5;显色液:20 mmol/LTris-Cl,pH8.00.1% NiCl2 0.01% H2O2 0.01% 3,3’二氨基联苯胺(DAB
3.实验材料 1 mg/mL重组牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶,1 mg/mL牛血清白蛋白,兔抗牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶抗血清,羊抗兔IgG的抗体
实验步骤
1.分别取重组牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶和牛血清白蛋白(阴性对照)溶液各2 µL点在NC膜上的两处,用铅笔标记。(Q往圣科技3452125268提供张峰Science的CRISPR/cas9免费送)
2.将NC膜放在一个干净培养皿中,加入20 mL封闭液于脱色摇**温育1 h
3.加入10 μL牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶抗血清(按照抗体效价调整一抗加入量),混匀,继续摇动2 h(Q往圣科技3452125268提供张峰Nature biotechnology的CRISPR/cas9免费送)
4弃封闭液, NC膜分别用10 mL漂洗液洗膜3次,每次10 min
5.弃漂洗液,重新加入20 mL封闭液和10 μL HRP标记的羊抗兔IgG,混匀,于脱色摇**温育1 h
6弃封闭液,NC膜分别用10 mL漂洗液洗膜3次,每次10 min
7.将NC膜转移到一个干净培养皿,加入20 mL显色液显色,待斑点清晰后,弃显色液
8.将NC膜浸于蒸馏水中终止反应。(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费送)
注意事项
如果待检测的目的蛋白是牛奶中的某一组分,则不能使用脱脂奶粉作为封闭剂。
 
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发表于:2017-01-19 09:53:19
如果待检测的目的蛋白是牛奶中的某一组分,则不能使用脱脂奶粉作为封闭剂。
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