帖子主题: 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达  

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发表于:Thu Jan 19 09:52:04 CST 2017

外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

实验目的

熟悉异丙基-β-D 硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,简称IPTG)诱导外源基因在大肠杆菌中表达的原理和方法。
实验原理】(Q往圣科技3452125268提供12万种免费质粒)
E.coliBL21(DE3)染色体DNA中插入了T7 RNA聚合酶基因,该基因的上游为Lac启动子,在正常条件下,大肠杆菌Lac操纵子中LacI编码的阻遏蛋白结合在该Lac启动子以及pET-15b 质粒T7启动子的附近LacO上,抑制T7 RNA聚合酶基因的表达,从而抑制了pET-15b T7启动子下游外源基因的表达。当培养基中存在 IPTG时,IPTG与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白成为非活性形式,解除了阻遏蛋白对Lac启动子和T7启动子的抑制,T7 RNA聚合酶基因表达,它与T7启动子结合诱导其下游外源基因的转录,转录产生的mRNA经过翻译表达出目的蛋白。(基金论文,你提供实验材料,我免费给你做实验,成果归你享有Q往圣科技3452125268 )
本实验选用的工程菌为转化了pET-15bcrtEE.coliBL21(DE3)pET-15crtE是通过将噬夏孢欧文氏菌(Erwiniauredovora)编码牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶的crtE,在Nde IXho I位点克隆到pET-15b中而构建的,crtE的起始密码子(ATG)与pET-15b上的多聚组氨酸标签(His-tag)的编码序列融合。crtE基因全长906 bp,编码蛋白(包括His-tag)的分子量约为35 kDa
器材与试剂】(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)
1.
实验仪器
细菌培养箱,摇床,台式离心机,微量移液器,电泳仪,电泳槽,电炉

(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装)
2.实验试剂
蛋白胨,酵母提取物,NaCl,1 mol/L NaOH,氨苄青霉素钠,1 mol/L IPTG(微孔滤膜过滤除菌), 30%凝胶贮液:29%丙烯酰胺,1% N,N-亚甲双丙烯酰胺;10%十二烷基硫酸钠(SDS),N,N,N’,N’-四甲基乙烯二胺(TEMED),10%过硫酸铵,标准分子量蛋白,蛋白电泳缓冲溶液:25 mmol/L Tris, 250 mmol/L 甘氨酸,0.1%SDS,pH8.3;1.5 mol/L Tris-Cl(pH8.0),1 mol/L Tris-Cl(pH6.8),蛋白栽样缓冲液(2×):50 mmol/L Tris-Cl(pH6.8),100 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT),2% SDS,10%甘油,0.1%溴酚蓝;染色液:0.2%考马斯亮蓝 R250,40%(v/v)甲醇,10%(v/v)乙酸;脱色液:40%(v/v)甲醇,10%(v/v)乙酸

3.实验材料 pET-15b,pET-15bcrtE,E.coliBL21(DE3)
实验步骤】(Q往圣科技3452125268提供12万种Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装)1.将pET-15b,pET-15bcrtE分别转化E.coliBL21(DE3),涂布在含100 µg/mL 氨苄青霉素钠的LB培养基平板上,37,培养至菌落清楚。(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费基因慢病毒包装)
2.分别挑取转化pET-15b(对照)和pET-15bcrtE的大肠杆菌单菌落,接种于20 mL100 µg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中,37,振荡培养(250 r/min)过夜。
3. 2 mL过夜培养物分别接种到20mL100 μg/mL氨苄青霉素钠的LB液体培养基中,相同条件下继续培养3 h(Q往圣科技3452125268提供免费基因慢病毒包装)
4.分别加入20 μLIPTG溶液,相同条件下,继续培养3 h
5.分别取300 μL培养物于一Eppendorf管中,10 000 rpm离心1 min,取沉淀。
6.沉淀用20 μL蒸馏水悬浮,加入20 μL
蛋白载样缓冲液,混匀,100煮沸5 min
7.冷却后,剧烈震荡
剪断DNA10 000 rpm离心10 min
8.分别取对照和工程菌样品20 μL用于SDS-PAGE分析,分离胶的浓度为12%
9.凝胶用染色液染色12 h,用脱色液脱色至条带清晰。
10.比较只转化pET-15b的对照菌和工程菌蛋白条带的差异,找出外源基因编码的目的蛋白。
注意事项】(你提供质粒,我给你免费包装成慢病毒Q往圣科技3452125268)
1.为了获得较高的目的蛋白表达水平,加入IPTG诱导时的工程菌培养物的OD600最好不要超过1。(你提供实验材料,我免费给你做实验,成果归你享有Q往圣科技3452125268)2.为了获得比较好的电泳效果,在进行SDS-PAGE分析前应剧烈振荡样品,剪断DNA以降低样品黏度,并离心去除不溶性的细胞裂解物。
 
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发表于:2017-01-19 09:53:46
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